Helmholtz étudie à l'école de Potsdam où son père enseigne la philologie et la littérature classique. Il s'intéresse à la physique et veut l'étudier à l'université, mais les difficultés financières de sa famille le poussent à étudier la médecine pour laquelle il reçoit une bourse contre l'engagement de travailler pendant 10 ans en tant que médecin dans l'armée prussienne après avoir reçu son diplôme.

En 1838 Helmholtz commence ses études de médecine et de chirurgie à Berlin, mais en parallèle, il suit des cours dans divers domaines scientifiques à l'université. Il étudie seul les travaux de Laplace, Biot, Bernoulli, Carnot, Joule et d'autres. En 1841 il rédige sa thèse sur la physiologie en basant son étude sur les principes de la physique et de la chimie. Il obtient le diplôme de médecine en 1843 et travaille pour l'armée à Potsdam.

Helmholtz emploie tout son temps libre à la recherche sur le principe d'économie de l'énergie qu'il applique à une variété de situations. Il démontre que l'énergie lorsqu'elle semble être détruite, est en fait convertie en énergie calorifique. Il publie en 1849 un article étudiant un nombre important d'applications comprenant les collisions, la contraction du muscle, l'électrostatique, les phénomènes galvaniques, l'électrodynamique et d'autres situations. Cet article est accueilli par la communauté scientifique avec tellement d'enthousiasme qu'Helmholtz reçoit la chaire de physiologie à Königsberg, il est libéré de son obligation envers l'armée.

A Königsberg il rédige le travail important sur l'optique physiologique et la théorie de la vision des couleurs. Il invente l'ophthalmoscope en 1851 et gagne rapidement une réputation internationale.

En 1855, il s'installe avec sa famille à Bonn et 3 ans plus tard il essaye de donner une base mécanique à la thermodynamique dans un article sur l'énergie des gaz parfait, décomposant celle-ci en une énergie de translation, de rotation et de déformation.

Il rejoint l'université de Heidelberg en 1858 puis dirige l'institut de physique de Berlin à partir de 1871, il produit une étude importante en 1862 sur la théorie musicale et la perception des sons utilisant la série de Fourier. En même temps que gauss, Riemann et Lobachevsky il fonde la nouvelle géométrie non-euclidienne.

Après sa nomination à Berlin, Helmholtz travaille sur l'électrodynamique. Il discute avec Weber la compatibilité de l'électrodynamique de Weber avec le principe de l'économie de l'énergie, cette discussion dure des années sans arriver à une conclusion, jusqu'à ce que Maxwell énonce sa théorie en 1880.